Лишь 26 июля 1522 г. новая турецкая армада в составе 103 галер и 300 транспортных и вспомогательных судов подошла к побережью Родоса. На острове высадилась 120-тысячная турецкая армия. 28 июля на театр военных действий прибыл лично султан Сулейман в сопровождении отборных отрядов янычар.
В конце ноября турки предприняли штурм Испанского и Итальянского бастионов, но были отражены. Рассвирепевший султан Сулейман распорядился начать новую бомбардировку города. 17 декабря пал Испанский бастион. Вопрос о сдаче города отныне становился лишь вопросом времени: все валы и стены были разрушены, дальнейшее сопротивление было равносильно само убийству. 20 декабря гроссмейстер Вилльер л’Исль обратился к султану с просьбой о перемирии, а 22 декабря было объявлено о почетной сдаче крепости.
Вечером 1 января 1523 г. при звуках трубы оставшиеся в живых рыцари-иоанниты на глазах у всего турецкого войска с оружием в руках, в боевых доспехах, с развернутыми знаменами и барабанным боем проследовали в парадном строю через весь город до Галерной гавани, где погрузились на ожидающие их корабли. Спустя 213 лет своего существования цитадель госпитальеров пала.
В течение следующих четырех столетий Родос оставался турецким владением, но эта эпоха почти не оставила своего отпечатка на облике города и острова. Турки построили – как, впрочем, и разрушили – сравнительно немного. Дворец гроссмейстеров использовался ими как хлев для скота, а гостиницы для паломников были обращены в казармы.
Сегодняшний Родос разделен на две части – старую и новую. Верхний, или Старый, город, заключенный в пределы стен средневековой крепости, в основном сохранил свой готический облик. Многие находят его очень похожим на французский Авиньон. Он имеет радиально-кольцевую планировку, где все главные улицы стекаются к одному центру: дворцу гроссмейстеров ордена госпитальеров (XIV в.) – с башнями и внутренним двором, окруженным аркадами. Ближе к морю расположены арсенал, госпиталь XV в., в котором сейчас действует археологический музей, дворец каштеляна (XIV–XV вв.), собор Св. Иоанна. В Нижнем городе готическая архитектура соседствует с исламской. После захвата Родоса турки построили в городе несколько мечетей, а также приспособили под мечети ряд церквей. В некоторых из них до сих пор сохранились византийские фрески.