Nun ergriffen die Böhmen die Waffen zu seiner Vertheidigung, und ein blutiger Bürgerkrieg sollte sich nun zwischen beiden Brüdern entzünden. Aber Rudolph, der nichts so sehr fürchtete, als in dieser sklavischen Abhängigkeit von den Ständen zu bleiben, erwartete diesen nicht, sondern eilte, sich mit dem Erzherzog, seinem Bruder, auf einem friedlichen Wege abzufinden. In einer förmlichen Entsagungsakte überließ er demselben, was ihm nicht mehr zu nehmen war, Oesterreich und das Königreich Ungarn, und erkannte ihn als seinen Nachfolger auf dem böhmischen Throne.
Theuer genug hatte sich der Kaiser aus diesem Bedrängniß gezogen, um sich unmittelbar darauf in einem neuen zu verwickeln. Die Religionsangelegenheiten der Böhmen waren auf den nächsten Landtag verwiesen worden; dieser Landtag erschien 1609. Sie forderten dieselbe freie Religionsübung, wie unter dem vorigen Kaiser, ein eigenes Consistorium, die Einräumung der Prager Akademie und die Erlaubniß, Defensoren oder Freiheitsbeschützer aus ihrem Mittel aufzustellen. Es blieb bei der ersten Antwort; denn der katholische Theil hatte alle Entschließungen des furchtsamen Kaisers gefesselt. So oft und in so drohender Sprache auch die Stände ihre Vorstellungen erneuerten, Rudolph beharrte auf der ersten Erklärung, nichts über die alten Verträge zu bewilligen. Der Landtag ging unverrichteter Dinge auseinander, und die Stände, aufgebracht über den Kaiser, verabredeten unter sich eine eigenmächtige Zusammenkunft zu Prag, um sich selbst zu helfen.
In großer Anzahl erschienen sie zu Prag. Des kaiserlichen Verbots ungeachtet, gingen die Beratschlagungen vor sich, und fast unter den Augen des Kaisers. Die Nachgiebigkeit, die er anfing zu zeigen, bewies ihnen nur, wie sehr sie gefürchtet waren, und vermehrte ihren Trotz; in der Hauptsache blieb er unbeweglich. Sie erfüllten ihre Drohungen und faßten ernstlich den Entschluß, die freie Ausübung ihrer Religion an allen Orten von selbst anzustellen und den Kaiser so lange in seinen Bedürfnissen zu verlassen, bis er diese Verfügung bestätigt hätte. Sie gingen weiter und gaben sich selbst die Defensoren, die der Kaiser ihnen verweigerte. Zehen aus jedem der drei Stände wurden ernannt; man beschloß, auf das schleunigste eine militärische Macht zu errichten, wobei der Hauptbeförderer dieses Aufstands, der Graf von Thurn, als Generalwachtmeister angestellt wurde. Dieser Ernst brachte endlich den Kaiser zum Nachgeben, wozu jetzt sogar die Spanier ihm riethen. Aus Furcht, daß die aufs Aeußerste gebrachten Stände sich endlich gar dem Könige von Ungarn in die Arme werfen möchten, unterzeichnete er den merkwürdigen Majestätsbrief der Böhmen, durch welchen sie unter den Nachfolgern dieses Kaisers ihren Aufruhr gerechtfertigt haben.
Die böhmische Confession, welche die Stände dem Kaiser Maximilian vorgelegt hatten, erhielt in diesem Majestätsbrief vollkommen gleiche Rechte mit der katholischen Kirche. Den Utraquisten, wie die böhmischen Protestanten noch immer fortfuhren sich zu nennen, wird die Prager Universität und ein eigenes Consistorium zugestanden, welches von dem erzbischöflichen Stuhle zu Prag durchaus unabhängig ist. Alle Kirchen, die sie zur Zeit der Ausstellung dieses Briefes in Städten, Dörfern und Märkten bereits inne haben, sollen ihnen bleiben, und wenn sie über diese Zahl noch neue erbauen lassen wollten, so soll dieses dem Herren- und Ritterstande und allen Städten unverboten sein. Diese letzte Stelle im Majestätsbriefe ist es, über welche sich nachher der unglückliche Streit entspann, der Europa in Flammen setzte.
Der Majestätsbrief machte das protestantische Böhmen zu einer Art von Republik. Die Stände hatten die Macht kennen lernen, die sie durch Standhaftigkeit, Eintracht und Harmonie in ihren Maßregeln gewannen. Dem Kaiser blieb nicht viel mehr, als ein Schatten seiner landesherrlichen Gewalt; in der Person der sogenannten Freiheitsbeschützer wurde dem Geist des Aufruhrs eine gefährliche Aufmunterung gegeben. Böhmens Beispiel und Glück war ein verführerischer Wink für die übrigen Erbstaaten Oesterreichs, und alle schickten sich an, ähnliche Privilegien auf einem ähnlichen Wege zu erpressen. Der Geist der Freiheit durchlief eine Provinz nach der andern; und da es vorzüglich die Uneinigkeit zwischen den österreichischen Prinzen war, was die Protestanten so glücklich zu benutzen gewußt hatten, so eilte man, den Kaiser mit dem König von Ungarn zu versöhnen.
Aber diese Versöhnung konnte nimmermehr aufrichtig sein. Die Beleidigung war zu schwer, um vergeben zu werden, und Rudolph fuhr fort, einen unauslöschlichen Haß gegen Matthias in seinem Herzen zu nähren. Mit Schmerz und Unwillen verweilte er bei dem Gedanken, daß endlich auch das böhmische Szepter in eine so verhaßte Hand kommen sollte; und die Aussicht war nicht viel tröstlicher für ihn, wenn Matthias ohne Erben abginge. Alsdann war Ferdinand, Erzherzog von Grätz, das Haupt der Familie, den er eben so wenig liebte. Diesen sowohl als den Matthias von der böhmischen Thronfolge auszuschließen, verfiel er auf den Entwurf, Ferdinands Bruder, dem Erzherzog Leopold, Bischof von Passau, der ihm unter allen seinen Agnaten der liebste und der verdienteste um seine Person war, diese Erbschaft zuzuwenden. Die Begriffe der Böhmen von der Wahlfreiheit ihres Königreichs und ihre Neigung zu Leopolds Person schienen diesen Entwurf zu begünstigen, bei welchem Rudolph mehr seine Parteilichkeit und Rachgier als das Beste seines Hauses zu Rath gezogen hatte. Aber um dieses Projekt durchzusetzen, bedurfte es einer militärischen Macht, welche Rudolph auch wirklich im Bisthum Passau zusammenzog. Die Bestimmung dieses Corps wußte Niemand; aber ein unversehener Einfall, den es, aus Abgang des Soldes und ohne Wissen des Kaisers, in Böhmen that, und die Ausschweifungen, die es da verübte, brachte dieses ganze Königreich in Aufruhr gegen den Kaiser. Umsonst versicherte dieser die böhmischen Stände seiner Unschuld – sie glaubten ihm nicht; umsonst versuchte er den eigenmächtigen Gewaltthätigkeiten seiner Soldaten Einhalt zu thun – sie hörten ihn nicht. In der Voraussetzung, daß es auf Vernichtung des Majestätsbriefes abgesehen sei, bewaffneten die Freiheitsbeschützer das ganze protestantische Böhmen, und Matthias wurde ins Land gerufen. Nach Verjagung seiner Passauischen Truppen blieb der Kaiser, entblößt von aller Hilfe, zu Prag, wo man ihn, gleich einem Gefangenen, in seinem eigenen Schlosse bewachte und alle seine Räthe von ihm entfernte. Matthias war unterdessen unter allgemeinem Frohlocken in Prag eingezogen, wo Rudolph kurz nachher kleinmüthig genug war, ihn als König von Böhmen anzuerkennen. So hart strafte diesen Kaiser das Schicksal, daß er seinem Feinde noch lebend einen Thron überlassen mußte, den er ihm nach seinem Tode nicht gegönnt hatte. Seine Demüthigung zu vollenden, nöthigte man ihn, seine Unterthanen in Böhmen, Schlesien und der Lausitz durch eine eigenhändige Entsagungsakte aller ihrer Pflichten zu entlassen; und er that dieses mit zerrissener Seele. Alles, auch die er sich am meisten verpflichtet zu haben glaubte, hatte ihn verlassen. Als die Unterzeichnung geschehen war, warf er den Hut zur Erde und zerbiß die Feder, die ihm einen so schimpflichen Dienst geleistet hatte.
Indem Rudolph eines seiner Erbländer nach dem andern verlor, wurde die Kaiserwürde nicht viel besser von ihm behauptet. Jede der Religionsparteien, unter welche Deutschland vertheilt war, fuhr in ihrem Bestreben fort, sich auf Unkosten der andern zu verbessern, oder gegen ihre Angriffe zu verwahren. Je schwächer die Hand war, welche das Scepter des Reichs hielt, und je mehr sich Protestanten und Katholiken sich selbst überlassen fühlten, desto mehr mußte ihre Aufmerksamkeit auf einander gespannt werden, desto mehr das gegenseitige Mißtrauen wachsen. Es war genug, daß der Kaiser durch Jesuiten regiert und durch spanische Ratschläge geleitet wurde, um den Protestanten Ursache zur Furcht und einen Vorwand zu Feindseligkeiten zu geben. Der unbesonnene Eifer der Jesuiten. welche in Schriften und auf der Kanzel die Gültigkeit des Religionsfriedens zweifelhaft machten, schürte ihr Mißtrauen immer mehr und ließ sie in jedem gleichgültigen Schritt der Katholischen gefährliche Zwecke vermuthen.