Стандартный механизм полуконсервативной репликации ДНК с образованием репликативной вилки включает следующие стадии:
1 Инициация репликации расплетением днДНК хеликазой. Репликация начинается не в случайной точке, а в специфическом месте, называемом точкой начала репликации (ori), которых может быть одна или несколько.
2 Синтез РНК-затравки ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой.
3 Синтез комплементарных цепей ДНК-полимеразой (II, III). Цепи ДНК синтезируются в результате присоединения дезоксинуклеотидов к 3'-концу растущей цепи, то есть в направлении от 5'– к 3'-концу вдоль матричной цепи. Синтеза цепей в обратном направлении не происходит. Поэтому синтезируемые цепи в репликативной вилке растут в противоположных направлениях. Синтез одной цепи происходит непрерывно – это ведущая, или лидирующая цепь. Синтез другой цепи идет импульсами – это отстающая цепь. Лидирующая цепь синтезируется в направлении роста репликативной вилки, отстающая – в обратном направлении в результате нескольких актов инициации. В итоге образуется несколько коротких цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи. Механизм репликации лидирующей и отстающей цепей в принципе одинаков и требует синтеза коротких РНК-затравок, комплементарных матричной цепи. Скорость копирования в репликативной вилке постоянна и равна 1,5 т.п.н./с.
4 Дезинтеграция РНК-затравки РНКазой Н.
5 Сшивание фрагментов Оказаки ДНК-лигазой.
6 Снятие сверхспирализации топоизомеразами (топоизомераза I – вносит разрывы в одну цепь, топоизомераза II – вносит разрывы в обе цепи).
Терминация синтеза.
1 Терминация синтеза и расхождение кольцевых геномов упрощены, поскольку синтез цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3'– и 5'-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой.
2 В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3'-концом и пробелом на 5'-конце. Предложено 2 способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи (рисунок 7).
В 1972 г. Уотсон предложил модель завершения репликации ДНК с прямыми повторами на концах через образование конкатемеров, которые представляют собой несколько тандемно-повторяющихся единиц генома. После образования конкатемера специфическая эндонуклеаза вносит ступенчатый разрыв в месте воссоединения. Это приводит к образованию выступающих 5'-концов и пробелов на 3'-конце, которые наращиваются