После смерти старца Льва брат Александр около четырех лет был келейником о. Макария. В 1842 г. его постригли в мантию с именем Амвросий, в 1846 году – рукоположили в иеромонаха. Вскоре отец Амвросий заболел столь серьезно, что никто не надеялся на выздоровление, и он принял схиму. Эта тяжелая болезнь продолжалась более года и имела очень большое значение для духовной жизни батюшки. Потеряв надежду на улучшение здоровья, он в декабре 1847 г. подал прошение об оставлении его в обители за штатом. Тогда ему было всего лишь 36 лет.
Наставником будущего святого был старец Макарий, под чьим руководством о. Амвросий смог обучиться искусству из искусств – умной молитве. Он нес два важных послушания: помогал старцу Макарию в издании святоотеческих трудов и отвечал на письма. Так старец Макарий постепенно готовил себе преемника.
Отец Амвросий получил благословение на духовное окормление братии в очень молодом по монастырским меркам возрасте – менее 40 лет, но таково было доверие к нему опытных отцов, видевших его редкие дарования.
Через 40 дней после кончины старца Макария о. Амвросий перешел на жительство в корпус рядом со скитской оградой, на его западной стороне была сделана пристройка, называемая «хибаркой», для приема женщин. В келье прп. Амвросия была самая скудная обстановка: несколько икон, кровать с холщевым, набитым соломой тюфяком и такой же подушкой – вот и все ее убранство. При старце были два келейника: о. Михаил и о. Иосиф (Литовкин), будущий старец. Главным письмоводителем стал высокообразованный человек – о. Климент (Зедергольм), сын протестантского пастора, перешедший в Православие.
При всей своей крайней немощи и болезненности, приковывавшей его почти всегда к постели, прп. Амвросий с утра и до поздней ночи, с небольшим перерывом для обеда и краткого отдыха, принимал посетителей, и эта его деятельность продолжалась непрерывно в течение 30 лет, до отъезда в Шамордино. Он имел огромное духовное влияние не только на братию монастыря, но и на мирских людей всякого звания и положения. Среди посетителей старца были и представители интеллигенции, многие из которых благодаря отцу Амвросию смогли вернуться к вере, к Церкви, в своих жизненных исканиях найти путь к спасению. К нему обращались знаменитые писатели Ф.М. Достоевский, Л.Н. Толстой, философы В.С. Соловьев и К.Н. Леонтьев и многие другие известные люди.
Большое влияние оказал старец Амвросий на Константина Николаевича Леонтьева (1831–1891) – замечательного писателя, философа, публициста. Еще отроком после одной из поездок в Оптину пустынь он сказал