Diagnóstico de Toxocara canis
El propósito de este aparte es sugerir diferentes metodologías, basadas en fundamentos distintos para realizar el diagnóstico de toxocariasis.
Ensayo inmunoenzimático
La técnica de ensayo inmunoenzemático (ELISA, por su sigla en inglés) permite determinar la concentración del antígeno o del anticuerpo mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro en solución; el complejo antígeno-anticuerpo se detecta a través de una enzima que reacciona con su sustrato. Las enzimas más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa y beta-D-galactosidasa. La reacción enzimática se detiene en la fase lineal de la curva con la incorporación de ácidos o bases fuertes, según el tipo de sustrato. La cantidad de producto formado en la reacción se mide en un espectofotómetro, al leer la densidad óptica a la longitud de onda, en la cual el color generado tiene su máxima absorción (17-23).
En Colombia, esta técnica se usa con mayor frecuencia para la búsqueda de anticuerpos. En este caso, el antígeno se fija a la fase sólida y luego se agrega la muestra en la que se sospecha que se encuentra el anticuerpo específico. A continuación, se agrega otro anticuerpo dirigido contra el anticuerpo específico de interés; este segundo anticuerpo está unido o conjugado a la enzima. Finalmente, el sustrato de la enzima se incorpora en la placa, con lo que se produce una reacción colorimétrica que se cuantifica con espectrofotómetro. Durante el proceso de estandarización de la prueba de ELISA, se establece el punto de corte que sirve de referencia para determinar si la muestra analizada es positiva o negativa (17-23).
Obtención de parásitos adultos de Toxocara canis y embrionación de los huevos
La obtención de parásitos adultos y la embrionación de los huevos de Toxocara canis son un procedimiento importante en la producción del antígeno secretor/ excretor usado en la técnica ELISA para la detección de anticuerpos (23). Para la obtención de los adultos de T. canis, se sugiere elegir alguna de las siguientes opciones y llevarla a cabo:
1. Entrar en contacto con centros veterinarios que realicen diagnóstico parasitológico y puedan proporcionar los especímenes una vez los caninos hayan sido sometidos a tratamiento antihelmíntico.
2. Entrar en contacto con centros de zoonosis, a fin de que proporcionen los parasitos adultos de T. canis postratamiento o por procedimientos de necropsia.
3. Infectar caninos experimentalmente con huevos de T. canis bajo condiciones de bioterio y obtener los adultos por procedimientos estandarizados y reglamentados en los protocolos de bioética y bienestar animal establecidos en la normatividad nacional e internacional.
Todos estos procedimientos deben ser realizados por profesionales debida mente capacitados y certificados.
Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: jeringas de 5 ml con su respectiva agua, equipo de disección —es decir, tijeras, pinzas, cuerda o sedade cirugía, etc.–, gasa, papel craft, toallas absorbentes desechables, bolsas para disposición de desechos biológicos, cajas de Petri, guantes quirúrgicos, tapabocas, estereoscopio, jabón antiséptico, microscopio, centrífuga, fiolas de 125 ml, baño serológico a 28 °C, incubadora a 37 °C, termómetro, vasos de precipitado, Tranquilan®, solución de eutanasia (ver anexo 7) y pepsina ácida (ver anexo 8).
Procedimiento
1. Una vez obtenidos los parásitos adultos, colocarlos en solución salina al 0.85 % en un vaso de precipitado.
2. Luego de colectar todos los parásitos, lavarlos con agua corriente varias veces para dejarlos libres de desechos.
3. Colocar los parásitos de nuevo en solución salina al 0.85 % y seleccionar las hembras con ayuda del estereoscopio. Las hembras se caracterizan por ser de mayor longitud y presentar el extremo posterior romo; los machos son más cortos y el extremo posterior termina en una espícula que les confiere una forma puntiaguda.
4. Desechar los machos en bolsas para disposición de desechos biológicos y extraer los úteros grávidos de las hembras. Para ello, asegurar cada hembra con una pinza, cortar ambos extremos del parásito y, con ayuda de otra pinza, hacer presión a lo largo del cuerpo hasta extraer el contenido completo. Depositar los úteros en una solución de pepsina ácida al 1 %.
5. Dejar el material obtenido en agitación magnética a 37 °C por 2 horas.
6. Realizar tres lavados con agua destilada en tubos de centrífuga (aproximadamente 1:10) durante 5 minutos a 100 g.
7. Preparar una solución de formalina al 1 % en fiolas de 125 ml.
8. Mezclar 50 ml de esta solución y 1 ml (aproximadamente) del sedimento obtenido.
9. Dejar las fiolas en incubación a 28 °C por 28 días en presencia de luz (día y noche) y con agitación ligera (cada 24 horas). La embrionación debe controlarse de manera microscópica a partir del día 20; cuando el 80 % de los huevos esté embrionado, la muestra estará lista para ser administrada a animales o para continuar con el procedimiento de obtención de larvas y del antígeno secretorio/excretorio.
Descortezamiento de los huevos y obtención de larvas II de Toxocara canis Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: vasos de precipitado, probetas, balanza, agitador magnético, incubadora a 37 °C, microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, guantes, tubos plásticos para centrífuga, solución descortezadora (ver anexo 9), solución equilibrada de Hanks (ver anexo 10), medio de cultivo de larvas de Toxocara canis, pipetas automáticas y puntas, papel indicador de pH y campana de CO2.
Materiales y reactivos estériles
Los materiales y reactivos estériles necesarios para este método son: fiolas, frascos, probetas, gasas, tubos de tapa rosca, medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle (DME, por su sigla en inglés) (ver anexo 11), microscopio invertido y pipetas Pasteur.
Procedimiento
1. Lavar los huevos de Toxocara canis con solución salina al 0.85 % tres veces durante 3 minutos a 500 g. Repetir los tres lavados con agua desionizada.
2. Medir la cantidad de sedimento remanente (±5 ml).
3. Preparar la solución descortezadora.
4. Colocar la suspensión obtenida en agitación suave a 37 °C por 2 horas. Revisar el proceso al microscopio cada 30 minutos.
5. Centrifugar para eliminar la solución descortezadora.
6. Lavar con agua destilada estéril de 5 a 10 veces, centrifugando a 800 g por 5 minutos. Realizar el último lavado con solución equilibrada de Hanks en centrífuga refrigerada a 850 g.
7. Recolectar el sedimento en un tubo, realizar el recuento y hacer los cálculos respectivos:
Ejemplo:
2 ml→160 larvas
X→10 000 larvas
X = 125 ml de solución equilibrada de Hanks. Adicionar 200 ml
de solución equilibrada de Hanks para compensar las pérdidas.
10 000 larvas → Aproximadamente 5 ml de medio DME.
8.Agregar 200 larvas por tubo. Teniendo en cuenta las pérdidas, pueden obtenerse 17 tubos y 2 controles de medio.
9.Incubar los tubos a 37 °C en atmósfera de CO2 al 10 % y de medio de DME.
Preparación del medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle para mantenimiento de larvas II de Toxocara canis
1. Preparar 1000 ml de medio con H2O destilada estéril.
2. Retirar una alícuota de 100 ml con NaHCO3 y medir el pH.
3. La solución de bicarbonato es una solución volátil y es estable por 1 mes si se guarda en condiciones