При имп. Анне Ивановне в 1733 г. было приступлено к постройке Украинской линии, прошедшей по южной части Харьковской и Полтавской губерний (Изюмский, Змиевский, Константиноградский, Валковский и Кобеляцкий уезды). К постройке этой линии казаки были привлечены наравне с крестьянами, причем были обложены тяжелыми повинностями. Новая линия была заселена военными поселянами из однодворцев, называвшимися ландмилиционерами. После Апостола управление Малороссией сосредотачивалось в руках «правления гетманского уряда», состоявшего из 6 членов – трех великорусов и трех малорусов. При Елисавете Петровне описываемыми тремя губерниями некоторое время управляла войсковая генеральная канцелярия, а в 1750 г. под давлением правительства, был выбран гетманом Кир. Григ. Разумовский. Новый гетман щедро раздавал малороссийские земли «в вечное и потомственное свое и наследников своих владение», а в 1760 г. затруднил переход крестьян от одних владельцев к другим. Имп. Екатерина II решительно высказалась против малороссийских «конфирмованных привилегий».
В 1764 г. восстановлена была малороссийская коллегия из 4 великорусов и 4 малорусов, а гетманство уничтожено. Для защиты границ казаки оказались уже ненужными. Новая оборонительная линия против крымцев, построенная в 1764 г., прошла уже южнее Малороссийской области – в пределах Екатеринославской губ., и быстро заселилась новыми поселенцами – черногорцами, сербами, калмыками. В 1775 г., по приказанию императрицы, было разорено гнездо казацких вольностей – Запорожская Сечь, а земли, принадлежавшие ей, розданы русским вельможам. Часть запорожцев вошла в состав новообразованного Черноморского войска, другая же выселилась в Турцию, основав в Добрудже так называемую Задунайскую Сечь. В 1828 г. казаки Задунайской Сечи, с разрешения имп. Николая I, возвратились в Россию и были поселены в Аккерманском уезде Бессарабской губ. По присоединении Крыма в 1783 г. казачество потеряло всякое значение. Казачьи полки обратились в регулярные карабинерские. Окончательно упрочилось и крепостное право. В 1783 г. был запрещен свободный переход крестьян, и введено подушное обложение. Жалованная грамота дворянству в 1785 г. распространилась и на малороссийскую шляхту, уравнивая ее в правах с русским дворянством. В 1786 г. произошло отобрание монастырских земель, а население последних было обращено в государственных крестьян. В административном отношении Малороссия была разделена на наместничества, из которых при Павле I образована одна, а в 1802 г. две малороссийских губернии – Черниговская и Полтавская; Харьковская же губерния получила свое окончательное устройство в 1836 г. При Николае I были уничтожены и последние остатки малороссийских вольностей – магдебургское право и судопроизводство по литовскому статусу. Так самостоятельная