По окончании войны, заслужив весьма лестный отзыв от Пирогова, молодой врач отправился за границу для усовершенствования своей квалификации. Он стажировался в лучших клиниках и лабораториях Германии, Австрии, Франции. Вернувшись в Россию в 1860 г., Боткин был приглашен в качестве адъюнкта к профессору Шипулинскому в Медико-хирургическую академию в Петербурге (ныне – Военно-медицинская академия). Сергей Петрович внес свою оригинальную научную составляющую в учебный процесс, и в следующем году 29-летний ученый стал профессором кафедры академической терапевтической клиники, которой руководил 28 лет.
Для изучения проблем научной медицины и физиологии Сергей Петрович создал первую в России экспериментальную лабораторию. Из нее, в частности, вышло большое число работ, посвященных изучению в клинике и в эксперименте важнейших лекарств, в том числе открытых школой Боткина. Ни один смертный случай в его клинике не проходил без вскрытия, и врачи имели возможность убеждаться, насколько патолого-анатомические изменения соответствовали прижизненному диагнозу. Очень много ученый сделал для организации медицинской помощи беднякам. В 1861 г. он открыл при своей клинике первую бесплатную амбулаторию.
В связи с его заслугами в медицине уже в начале 1860-х гг. Боткин был назначен совещательным членом медицинского совета Министерства внутренних дел и военно-медицинского ученого комитета. Профессор первым из российских врачей стал почетным лейб-медиком Александра II.
Ученый был горячим сторонником права женщин на высшее медицинское образование, и в 1872 г. при его деятельном участии в Петербурге были открыты первые женские врачебные курсы. Вместе со своим другом, физиологом И.М. Сеченовым, Боткин первый в России предоставил возможность женщинам-врачам работать на своей кафедре.
Когда началась Русско-турецкая война 1877 – 1878 гг., профессор снова пошел в военный лазарет и приложил немало сил для улучшения условий жизни солдат и работы госпиталей. В 1877 г. ученый с возмущением писал с фронта о тех полководцах, которым «кровь русского солдата не дорога». Военно-полевая терапия обязана ему многими ценными новшествами в вопросах эвакуации раненых с поля боя, оказания им первой помощи, устройства госпиталей, организации санитарной и противоэпидемиологической служб. Он также внес много нового в улучшение программы подготовки военных врачей в Медико-хирургической военной академии.
Чрезвычайно плодотворной была деятельность профессора в качестве гласного городской думы Санкт-Петербурга. По его инициативе и указаниям город энергично взялся за улучшение содержания больниц и приступил к устройству новых – общины Св. Георгия и Александровской барачной больницы для малоимущих. Благодаря его настойчивости в начале 1880-х гг. и в других городах России появились первые бесплатные лечебные учреждения