Среди настоятелей обители наиболее известен Иов (Желизо; ум. 1651), причисленный к лику святых. Он был известным на Волыни подвижником, автором полемических сочинений.
Трудами преподобного Иова Почаев стал в условиях противостояния в Украине католицизма и Православия крепкой твердыней последнего. Через семь лет после своей кончины преподобный несколько раз являлся во сне Киевскому митрополиту Дионисию Балабану и повелел открыть свои мощи. Обретенные в 1659 году, они стали последней из трех главных почаевских святынь (кроме следа Стопы Божией Матери и Ее чудотворной иконы), прославленных чудесами исцелений.
Когда в 1675 году окруженную деревянной оградой обитель решили штурмовать шедшие на Польшу турки, беженцы-миряне и братия могли противопоставить оружию нападавших только веру и молитву – акафист (молебно-хвалебное песнопение) к чудотворной Почаевской иконе. При пении «Взбранной Воеводе» над монастырем явилась Сама Пречистая с распростертым омофором в руках, небесными ангелами и преподобным Иовом, молящимся о спасении обители.
Увидев небесное воинство, турки стали пускать в него стрелы, но те возвращались и поражали стрелков. Объятые ужасом иноземцы бежали. Некоторые из них были пленены православными. Несколько пленников приняли христианство и остались до конца дней своих на послушании в Почаеве.
Долгое время находясь в составе польско-литовского, преимущественно католического государства, монастырь оставался православным, однако уже после присоединения Украины к России, в процессе усиления влияния Ватикана в западнославянских землях, был в 1720 обращен в униатский. К этому периоду относятся наиболее значительные сооружения, связанные с благотворительностью графа Н. Потоцкого.
Как-то в 1759 году лошади ехавшего мимо Почаева графа-католика Николая Потоцкого перевернули коляску. В ярости граф выхватил пистолет, чтобы убить не справившегося с управлением кучера. Поняв, что настал последний миг, тот повернулся в сторону видневшейся обители с молитвой к Божией Матери. Пистолет трижды дал осечку.
Обескураженный Потоцкий заметил в глазах кучера огонек какой-то безумной надежды и, выяснив в чем дело, немедля отправился в монастырь. Увидев образ, который молитвенно вспоминал кучер, граф принес покаяние и все свои материальные средства направил на благоустройство обители и прославление Почаевской иконы (добился признания ее в 1773 году католической церковью чудотворной с возложением на изображение Божией Матери короны).
В 1831 году монастырь вернулся в лоно Православия: после того как монахи-униаты поддержали польское восстание, император Николай I передал монастырь в ведомство православной епархии.
В 1834 году обитель «по многочисленности стекающихся в оную богомольцев, по великолепию ее церквей, обширности и огромности зданий» четвертой по счету среди русских монастырей получила титул лавры. Название это утвердилось еще при