1.4. Мультифотонная микроскопия
Мультифотонная микроскопия – вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Для этой цели применяются фемтосекундные лазеры с длительностью импульса около 10-13 с (100 фемтосекунд) и частотой порядка 100 МГц. Использование такой системы (при невысокой ее мощности) позволяет получить сигнал с малым уровнем фоновых шумов, достичь большей глубины проникновения в ткани при малой степени повреждения клеток. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. В качестве примера мультифотонного микроскопа можно привести комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710 с фемтосекундным инфракрасным лазером с перестраиваемым диапазоном (800 – 1500 нм). Использование этой системы позволяет получить глубину проникновения в ткани порядка 500 мкм и осуществлять непрерывный мониторинг живых объектов в течение нескольких часов.
Одним из вариантов мультифотонной микроскопии является микроскопия с использованием регистрации второй гармоники (Second-harmonic imaging microscopy – SHIM). Метод генерации второй гармоники основан на нелинейном оптическом явлении, суть которого заключается в преобразовании средой двух фотонов с частотой w в один фотон с частотой 2w. Это означает, что помимо света на частоте лазера из среды выходит свет на удвоенной частоте – вторая гармоника. Генерация второй гармоники обусловлена рассеянием света в среде и возможна при действии поляризованного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона. Подробное изложение физико-химических основ этого процесса приведено в учебнике под редакцией Б. И. Манцызова (2009). Отметим, что не все биологические образцы могут генерировать вторую гармонику. Классическим объектом для этого вида микроскопии является роговица глаза, которая преимущественно состоит из плотно упакованных коллагеновых волокон – источника генерации второй гармоники.
1.5. Конфокальная микроскопия в