Первоначальным ядром собрания стала коллекция античных статуй, собранных папой Юлием II в так называемом Внутреннем дворике статуй, который сегодня известен как Октагональный двор. Эти художественные коллекции в настоящее время размещены в различных зданиях в пределах музейного комплекса. Со временем коллекции так разрослись, что встал вопрос о необходимости выделения отдельных музеев. Папы Бенедикт XIV (1740–1758) и Климент XIII (1758–1769) основали два музея при Ватиканской Апостольской библиотеке: Священный (Museo Sacro, 1757) и Светский (Museo Profano, 1767). Позже папа Климент XIV (1769–1774) и кардинал Баски (будущий папа Пий VI) решили преобразовать в музей бывший дворец папы Иннокентия VIII, расширить старые и построить новые помещения для расширившихся коллекций. Строительные работы, которые длились 15 лет, были поручены архитекторам Симонетти и Кампорези. Старый антикварий для статуй был переделан, к нему пристроили восьмиугольный портик, и все эти помещения приспособили под музейные залы. Новый музей получил название Пио-Клементино (по имени Пия VI и Клемента XIV). Римские папы были в числе первых европейских суверенов, открывших художественные коллекции своих дворцов для широкой публики.
В 1797 г. договор между папой Пием VI и наполеоновской Францией лишил ватиканские музеи огромного числа бесценных произведений, которые были вывезены во Францию. Следующий папа, Пий VII (1800–1823), стремясь возместить потери, в первые же годы своего понтификата начал собирать произведения античного искусства. Собрание быстро пополнялось. Позднее для него по проекту архитектора Стерна было построено новое здание, которое получило название «Браччо Нуово» («Новое крыло»). В 1807–1810 гг. при участии выдающегося скульптора Антонио Кановы был организован музей Кьярамонти.
Художественные ценности, вывезенные во Францию, были возвращены в Рим только в 1816 г. по решению Венского конгресса. Среди возвращенных произведений было 73 картины, которые собраны в апартаментах Борджа. В 1822 г. был открыт музей в «Новом крыле» («Браччо Нуово»). Папа Григорий XVI (1831–1846) основал Этрусский музей (1837), куда поступали предметы из раскопок в Южной Этрурии, начавшиеся в 1828 г.; Египетский Музей (1839), коллекции которого пополнялись в результате археологических исследований в долине Нила, и Латеранский Светский музей (1844), где были собраны барельефы, статуи и мозаики римского периода. В 1854 г., при папе Пие IX, в Латеранском дворце открылся Христианский музей, в основу собрания которого легли находки в римских катакомбах, где собирались первые христиане – саркофаги,