1. Llenar la cámara de electrotransferencia con cantidad suficiente de buffer de transferencia.
2. Depositar el gel de corrido —el gel de stacking no es necesario para la transferencia— sobre una de las hojas de papel Whatman y colocarlo sobre una de las rejillas con espuma.
3. Colocar el papel de nitrocelulosa encima del gel y eliminar las burbujas. Colocar encima la otra hoja de papel Whatman y hacer presión sobre el montaje, al rodar un tubo de ensayo limpio sobre el papel Whatman para eliminar las burbujas entre el gel y el papel de nitrocelulosa.
4. Colocar encima la otra espuma y la otra rejilla. Asegurar el montaje y colocarlo en la cámara de electrotransferencia, confirmando que el papel de nitrocelulosa quede hacia el ánodo (+).
5. Programar las condiciones de la transferencia. Si se realiza con dos membranas se programan 150 mA durante 2 horas y media, mientras que, para un solo gel, se tarda 1 sola hora. La transferencia se hace a 4 °C, ya que el proceso puede ocasionar el calentamiento excesivo de la cámara.
Coloración de la transferencia con rojo Ponceau
▪ Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: rojo Ponceau (ver anexo 59), agua bidestilada, refractaria y solución para lavados (ver anexo 60).
▪ Procedimiento
1. Colocar la membrana en una refractaria limpia.
2. Lavar la membrana de nitrocelulosa con agua bidestilada.
3. Añadir rojo Ponceau en cantidad suficiente para cubrir la membrana y dejar en remojo durante 5 minutos.
4. Decolorar la membrana con agua bidestilada o solución de lavado para inmunoblot. Comprobar la aparición de bandas coloreadas de rojo, lo que indica el éxito de la transferencia. Lavar hasta que las bandas desaparezcan por completo.
Inmunoblot y revelado con fosfatasa
▪ Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: solución de trabajo PBS+Tween 20 PBS-T20 (ver anexo 14), solución para lavados (ver anexo 60), solución bloqueadora de actividad endógena (ver anexo 61), solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión (ver anexo 62) y solución activadora de la fosfatasa y solución reveladora (ver anexo 63).
▪ Procedimiento
1. Cortar la membrana en tiras de 0.6 cm de ancho, con cuidado de no cortar por el medio del frente de corrida de las bandas. Identificar uno de sus extremos con una marca de lápiz y colocar las tiras en tubos de ensayo limpios y llenos de agua bidestilada.
2. Colocar las tiras en solución bloqueadora de actividad endógena por 1 hora y luego realizar tres lavados con solución de lavado durante 5 minutos.
3. Colocar las tiras en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión y mantener a 4 °C y en agitación constante durante toda la noche; esto permite que las proteínas de la leche utilizada en la solución bloqueadora se peguen a los espacios vacíos de la membrana. El bloqueo también puede realizarse a 37 °C durante 1 hora.
4. Diluir la muestra (suero o sobrenadante) en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión recién preparada. La dilución del suero depende de la concentración de anticuerpos de este y de la concentración de proteínas en la transferencia, por lo cual inicialmente se deben probar diferentes diluciones (1:50, 1:100).
5. Incubar a 4 °C toda la noche o 1 hora a temperatura ambiente, con agitación constante. Luego, lavar la membrana cinco veces por 5 minutos en cada oportunidad con solución de trabajo PBS-T20.
6. Diluir el conjugado (anti-IgG o anti-IgM) en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión. La dilución del conjugado se ajusta según la resolución de las bandas y el background obtenido. Por lo general, se recomiendan diluciones de conjugado de 1:2000, 1:10 000 o 1:20 000, según las indicaciones de cada casa comercial.
7. Incubar 1 hora a temperatura ambiente y en agitación constante. Posteriormente, lavar cinco veces durante 5 minutos en cada ocasión, con PBS-T20.
▪ Revelado con fosfatasa alcalina
1. Lavar la membrana con solución activadora por 10 minutos.
2. Adicionar la solución reveladora y detener la reacción cuando las bandas muestren buena visibilidad. Este procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente.
3. Preparar el volumen necesario de solución reveladora. Para prepararla, por cada 10 ml de solución activadora, agregar 33 µl de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) y 66 µl de nitro azul de tetrazolio (NBT).
4. Descartar la solución reveladora restante (ver figura 1.5).
REFERENCIAS
1. World Health Organization. Schistosomiasis and soil-transmitted helminth infections. Ginebra: WHO; 2001. WHA45.19.
2. De Silva NR, Brooker S, Hotez PJ, Montresor A, Engels D, Savioli L. Soil-transmitted helminth infections: updating the global picture. Trends Parasitol. 2003;19(12):547-51. http://doi.org/czbpcn.
3. López MC, Moncada LI, Ariza-Araújo Y, Fernández-Niño JA, Reyes P, Nicholls RS. Evaluación de tres pruebas para el diagnóstico de geohelmintos en Colombia. Biomédica. 2013;33(1):128-36. http://doi.org/b7g8.
4. Carvalho GL, Moreira LE, Pena JL, Marinho CC, Bahia MT, Machado-Coelho GL. A comparative study of the TF-Test®, Kato-Katz, Hoffman-Pons-Janer, Willis and Baermann-Moraes coprologic methods for the detection of human parasitosis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2012;107(1):80-4. http://doi.org/dkh7.
5. World Health Organization. Cellophane faecal thick smear examination technique (Kato) for diagnosis of intestinal schistosomiasis and gastrointestinal helminth infections. Ginebra: WHO; 1983. PDP/ 83.3. Recuperado de https://bit.ly/2Q5lGvp.
6. Katz N, Chaves A, Pellegrino J. A simple device for quantitative stool thick smear technique in Schistosomiasis mansoni. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1972;14(6):397-400.
7. Tanyukselm M, Petri WA Jr. Laboratory diagnosis of amebiasis. Clin Microbiol Rev. 2003;16(4):713-29. http://doi.org/dfbzzd.
8. Faust EC, Russell PF, Jung RC. Craig and Faust’s clinical parasitology. 8a ed. Londres: Lea & Febiger; 1974.
9. World Health Organization. Basic laboratory methods in medical parasitology. Ginebra: WHO; 1991.
10. Ritchie LS. An ether sedimentation for stool examination. Bull U S Army Med Dep. 1948;8(4):326.
11. Beck JW, García A, Hartog EM, Shaner AL. Empleo de la técnica de recuento de huevos de Ritchie–Frick en el estudio de la efectividad del antihelmíntico nopar (yoduro de stilbazium). Rev Fac Med Unal. 1965;33(1):33-6. http://doi.org/dkh9.
12. Montresor A, Crompton DWT, Hall A, Bundy DAP, Savioli L. Lineamientos para la evaluación de la geohelmintiasis y la esquistosomiasis a nivel de la comunidad: guía para el manejo de los programas de control. Washington, D.C.: Organización Panamericana de la Salud; 1998. Serie HCT/AIEPI 16.E.
13. Bergquist R, Johansen M, Utzinger J. Diagnostic Dilemmas in Helminthology: what tools to use and when? Trends Parasitol. 2009;25(4):151-56. http://doi.org/d5cq9q.
14. Koga K, Kasuya S, Khamboonruang C, Sukhavat K, Ieda M, Takatsuka N et al. A modified agar plate method for detection of Strongyloides stercoralis. Am J Trop Med Hyg. 1991;45(4):518-21.