Western blot
El western blot es una técnica inmunológica que ayuda a determinar la presencia de proteínas de cierto peso molecular en pacientes con infección por E. histolytica reciente o pasada. En un estudio realizado en pacientes colombianos diagnosticados con absceso hepático amibiano, se identificó una banda de 38 kDa en el 93 % de los pacientes, una de 42 kDa en el 90 % y una de 80 kDa en el 86 %. En pacientes con absceso hepático mixto, las bandas de 80 kDa y 38 kDa fueron identificadas en el 100 % de los pacientes y la de 42 kDa, en el 75 % de ellos (60).
En otro estudio, que evaluó la frecuencia de bandas entre pacientes con infección reciente y pasada por E. histolytica, se encontraron bandas de 136 kDa, 132 kDa, 93 kDa, 70 kDa y 62 kDa en pacientes con absceso hepático amibiano, y bandas de 144 kDa, 140 kDa y 94 kDa asociadas con infección pasada (61). La figura 1.5 muestra el procedimiento de la realización de western blot para la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE, por su sigla en inglés) en medio discontinuo denaturante y la detección de anticuerpos anti-E. histolytica.
Figura 1.5. Procedimiento para la realización del western blot.
Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico en medio discontinuo denaturante
▪ Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: un par de vidrios con separadores; un peine del grosor de los separadores; un par de sujetadores (clamps) para vidrios; un stand para colocar el sándwich de electroforesis; cámaras de electroforesis; fuente de poder ajustable a corriente continua; tubos plásticos para centrífuga; baño serológico a ebullición; agua bidestilada; agua saturada con N-butanol (ver anexo 47) —este reactivo es opcional—; solución A: monómero para gel de separación (ver anexo 48); solución B: buffer para gel de separación (ver anexo 49); solución C: monómero para gel de stacking (ver anexo 50); solución D: buffer para gel de stacking (ver anexo 51); persulfato 2 % (ver anexo 52); gel de sellado (ver anexo 53); gel de corrido o separación (ver anexo 54); gel de stacking (ver anexo 55); buffer de Laemmli 2X o 4X (ver anexo 56); buffer de corrido (ver anexo 57); pipetas de 10 ml; micropipetas; tetrametiletilendiamina (TEMED); puntas para micropipetas; pipeteador; bisturí; guantes, y tapabocas.
▪ Precaución
Se debe siempre utilizar guantes de protección química EN374, a fin de evitar que los vidrios se engrasen y para protección personal, ya que los monómeros de acrilamida son neurotóxicos.
▪ Procedimiento
1. Lavar los vidrios, preferiblemente, con detergente 1A y agua abundante y manipularlos con sumo cuidado.
2. Secar los vidrios con papel absorbente, teniendo la precaución de que no queden residuos de grasa, jabón o papel.
3. Ensamblar la cámara de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Preparar 1 ml de persulfato de sodio al 2 %.
▪ Preparación del gel de sellado
1. Preparar el gel de separación sin aplicar persulfato ni TEMED. Para ello, agregar agua bidestilada, solución A y B.
2. En otro recipiente, separar 1 ml de la mezcla para gel de separación y agregar el persulfato y el TEMED. Servir con rapidez para evitar la polimerización.
3. Agregar 300 µl de la mezcla del gel de sellado en el sándwich de los vidrios, procurando hacerlo con rapidez y por las esquinas del montaje. Esperar que el gel polimerice de 20 a 30 segundos.
▪ Preparación del gel de separación
1. Agregar persulfato y TEMED a la solución de gel de separación restante.
2. Añadir la solución al sándwich de vidrios. Para ello, se utiliza una micropipeta de 1 ml (mínimo) y se vierte la solución con rapidez por las esquinas del montaje; se agregan aproximadamente 4 ml entre los vidrios a fin de dejar libre el espacio correspondiente al gel de stacking.
3. Agregar 450 µl etanol antes de que la acrilamida se polimerice. El etanol formará una capa a nivel a través de la superficie del gel en 1 o 2 minutos. Cuando el gel se polimerice, se observará una interfase nítida entre el etanol y el gel. En ese momento, retirar el etanol y secar con papel filtro.
4. Si el gel no se va a utilizar el mismo día, agregar agua bidestilada y 1 ml de solución B diluida 1:4. Almacenar el gel a 4 °C.
▪ Preparación del gel de stacking
1. Preparar la solución de gel de stacking.
2. Agregar la solución al sándwich de vidrios como se explicó antes. Por cada gel se utilizan aproximadamente 2.5 ml de esta solución. Llenar por completo el espacio disponible en el sándwich para este gel.
3. Introducir con cuidado el peine de plástico y evitar la formación de burbujas, porque inhiben la polimerización de la acrilamida y causan distorsión local en el fondo de los pozos.
4. Esperar por lo menos 10 minutos a que el gel polimerice.
Se recomienda no correr patrones de peso molecular en los pozos de los extremos del gel.
▪ Preparación de la muestra
1. Mezclar tres partes de la muestra con una parte de buffer Laemmli 4X; si el buffer es 2X, la relación entre muestra y buffer es de 1:1. Mezclar y llevar a ebullición durante 5 minutos. Ejemplo: 80.33 µl de antígeno + 66.67 µl PBS 1X + 50 µl buffer Laemmli 4X.
2. Retirar el peine. Para correr una sola muestra se pueden cortar los dientes restantes con bisturí, limpiando bien los restos del gel. Llevar a cabo el montaje del sándwich en la cámara de electroforesis.
3. Agregar buffer de corrido entre los bloques de la cámara para verificar que no se salga.
4. Colocar el sándwich y la cámara superior en su sitio, llenar con buffer de corrido por dentro y por fuera de la cámara hasta aproximadamente la mitad del nivel de contenedor.
5. Servir la muestra en los pozos con una pipeta. El patrón puede depositarse en uno de los pozos centrales del gel.
▪ Corrido electroforético
1. Colocar los electrodos en su lugar, asegurando que el cátodo quede en la parte superior.
2. Fijar la fuente de poder en la selección de corriente constante.
3. Correr la electroforesis inicialmente a 75 V por 15 minutos aproximadamente y cuando la muestra se acumule al fondo de los pozos, cambiar a un voltaje constante de 125 V. Dejar que el corrido continúe bajo estas condiciones durante 1 hora.
4. Detener el corrido cuando el frente de color esté en el borde del gel.
5. Sacar la cámara del contenedor y continuar con la transferencia.
Electrotransferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa
▪ Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: cámara de electrotransferencia, dos hojas de papel Whatman de 3 mm x 14 cm x 16 cm, una hoja de papel de nitrocelulosa de 14 cm x 16 cm, buffer de transferencia (ver anexo 58), guantes, tubo de ensayo grande y cuarto frío o recipientes con hielo para enfriar la cámara de transferencia.
▪ Procedimiento
Precaución: utilizar guantes durante todo el procedimiento y manipular con cuidado el papel de nitrocelulosa para evitar que se ensucie. Iniciar el procedimiento