Hay algunos factores que afectan la buena separación de los picos CG como la volatilidad de los analitos, volatilidad del disolvente, la concentración, diámetro de la columna, el grosor de la fase estacionaria y la temperatura inicial de la columna. El proceso de inyección de la muestra deberá minimizar la pérdida por descomposición o por absorción. En este punto es crucial le selección del disolvente, ya que el volumen de vapor generado durante la inyección de un volumen dado de diferentes disolventes no es el mismo, pero es dependiente del peso molecular y de la densidad del disolvente. Además, ese volumen generado es dependiente de la presión de cabeza de la columna, que depende del diámetro y la longitud de la columna y del gas de arrastre usado. En ese sentido, disolventes densos de bajo peso molecular como el agua y el metanol, crean grandes volúmenes de vapor. Otros factores que deben ser considerados son la compatibilidad del disolvente con el detector, el punto de ebullición del disolvente y la compatibilidad del disolvente con la fase estacionaria de la columna.
Cromatografía de gases-espectrometría de masas
Sin lugar a dudas la CG acoplada a espectrometría de masas (EM) es la técnica más usada en la identificación de semioquímicos, esta técnica combina las características de la CG con la EM para identificar compuestos presentes en una muestra. Para aquéllos interesados en conocer más sobre espectrometría de masas, pueden consultar McLafferty & Turecek (1993). El uso de un espectrómetro de masas como un detector de un cromatógrafo de gases fue desarrollado en 1950 por Roland Gohlke & Fred McLafferty. El espectrómetro de masas más comúnmente asociado a un cromatógrafo de gases es el llamado cuadropolo o detector selectivo de masas. Otro analizador bastante utilizado es de la trampa de iones. Otros analizadores menos usados, principalmente por sus altos costos, son el de sector magnético y el de tiempo de vuelo. En general, la técnica consiste en separar los compuestos por medio de la CG y conforme son separados, enviados al espectrómetro de masas, en donde los compuestos son ionizados mediante impacto de electrones y fragmentados. Los iones son separados en función de la relación masa/carga y la abundancia relativa de cada ion es registrada como el espectro de masas. Otra alternativa de ionización en fase gaseosa es mediante la ionización química, con este procedimiento es posible obtener el ion molecular que proporciona el peso molecular de un compuesto determinado.
El patrón de fragmentación de un compuesto se ajusta a un patrón similar correspondiente al grupo que pertenece y ésta es la información básica para la identificación de un compuesto. En la actualidad los nuevos equipos de GC-MS incluyen una base de datos (NIST) que contiene más de 200,000 espectros de masas del mismo número de compuestos. El espectro de masas obtenido de un compuesto determinado es comparado contra los compuestos de la base de datos y de esta manera la base de datos sugiere una identificación tentativa que deberá ser confirmada. Las identificaciones tentativas son confirmadas por comparación de los datos espectrales y de los tiempos de retención con aquéllos de estándares auténticos. En los casos en donde no se cuenta con los estándares, se calcula el índice de Kovats para cada compuesto y de esta forma se aproxima uno a la identificación. Otra posibilidad de confirmar la identificación cuando se cuenta con el sintético consiste en una co-inyección de una cantidad determinada del compuesto conocido y si es el compuesto es el correspondiente, entonces el área del pico en la muestra será mayor.
Otras técnicas de espectrometría de masas
La espectrometría de masas por reacción de transferencia de protones (PTR-MS por sus siglas en inglés) es otra técnica que se ha usado para la identificación de compuestos volátiles de plantas. La principal diferencia del espectrómetro de masas convencional es que el PTR-MS usa ionización química “suave” de las moléculas de los volátiles por reacción con iones de hidronio (H3O+) producidos por un origen externo de iones (Tholl et al., 2006). El espectrómetro de masas que usa un analizador cuadropolo está disponible comercialmente por Analytk GmbH, Austria. Este equipo permite la detección de los volátiles rápidamente con un bajo límite de detección (10-100 pptv). Recientemente también se ha desarrollado un espectrómetro de masas con un analizador de tiempo de vuelo por reacción de transferencia de protones (PRT-TOF por sus siglas en inglés) que permite la detección de volátiles de plantas en tiempo real (Brilli et al. 2011). El uso del analizador de tiempo de vuelo permite la detección completa e instantánea del espectro de masas total con un tiempo de resolución de menos de un segundo.
En algunos casos cuando los componentes de un semioquímico no son volátiles se ha usado espectrometría de masas por bombardeo rápido de átomos (FAB-MS por sus siglas en inglés). Por ejemplo, usando esta técnica, extractos conteniendo la feromona disuasiva de oviposición de Rhagoletis cerasi L. Fueron disueltos en una matriz líquida de tioglicerol y bombardeada con átomos de Xenón, obteniéndose el espectro de masas de una molécula que fue identificada como un derivado de taurina con dos centros quirales (Hurter et al., 1987).
Otras técnicas analíticas espectrales
Espectroscopia de infrarrojo (IR). Ésta es una técnica analítica que permite identificar los grupos funcionales presentes en una molécula. La región del infrarrojo en el espectro electromagnético comprende desde el rojo en el espectro visible hasta la región de las microondas entre 10 y 12,800 cm-1. Sin embargo, las aplicaciones analíticas relacionadas con la identificación de los grupos funcionales de los compuestos se encuentran en la región media del infrarrojo desde 670 a 4000 cm-1. La IR se fundamenta en que las moléculas tienen frecuencias a las cuales rotan y vibran, y estos movimientos tienen niveles de energía discretos. En el espectro de infrarrojo, la radiación incidente es absorbida cuando la energía de la radiación incidente coincide con la energía requerida para excitar un particular modo vibracional. La multiplicidad de vibraciones que ocurre simultáneamente produce un complejo espectro de absorción que es característico de grupos funcionales presentes en la molécula y de las configuraciones de los átomos. Por esto, el espectro de infrarrojo de un compuesto orgánico es considerado como la “huella digital”. Además, mediante la interpretación de la información proporcionada por el IR es posible determinar la presencia o ausencia de grupos funcionales específicos. Para el análisis por IR, la muestra es colocada en un micro disco de bromuro de potasio o disuelta en tetracloruro de carbono y colocado en una celda. La celda o el disco se colocan en un condensador por donde pasa el rayo de IR. Es importante que se elimine el disolvente para que la banda de absorción de éste no interfiera con la muestra. Posteriormente surgió la Transformada de Fourier, incorporándose al IR y convirtiéndose en FTIR lo que permitió obtener espectros más finos y con una menor cantidad de muestra. Años más tarde se combinó con la cromatografía de gases-infrarrojo con transformada de Fourier (GC-FTIR).