Для Софьи длительное отсутствие Петра в России стало последним шансом для возвращения себе власти. Весной 1698 года стрельцы снова взбунтовались. Помимо невыплаты им положенного денежного довольствия, непосредственным поводом для мятежа прослужило известие о намерении царя перевести четыре стрелецких полка для прикрытия западной границы. Для них это означало смену столичного приволья на трудную и опасную службу в пограничных городах. И на этот раз стрельцы выступали под излюбленным лозунгом «Софью на царство!», руководствуясь грамотами, которые через своих сестер Марфу и Марию передавала им из монастыря опальная царица. Однако стрельцы действовали не слишком решительно, и еще до приезда Петра мятеж был подавлен. В августе, по возвращении из Европы, царь лично принял участие в расследовании заговора: в течение недели были арестованы около четырех тысяч человек, в том числе все стрельцы, проходившие службу в мятежных полках. Началась настоящая охота на стрельцов, получившая громкое название «великий сыск».
Особый допрос Петр учинил Софье. Следствие располагало данными о том, что заговорщики поддерживали связь друг с другом через некую Офимку Кондратьеву, приживалку опальной правительницы. Втянутой в заговор была и царская сестра Марфа. По тому, какую роль играли в этом бунте женщины, его впору было назвать не стрелецким, а бабьим. Никаких прямых улик в виде писем, доказывающих вину Софьи, добыть не удалось. Не помогли и очные ставки царевны со стрельцами – она все отрицала. Историки задавались вопросом о том, подвергалась ли бывшая правительница, как и другие организаторы заговора, пыткам? И не имея достоверных данных, ответ на него давали чаще всего отрицательный. Свет на эти события пролил найденный в середине XIX века дневник Патрика Гордона, участвовавшего в подавлении стрелецкого