Он становится первым медиком, поставившим себе целью изучение строения живого организма с помощью микроскопа и выработавшим систематику и методологию микроскопического исследования
В альма-матер он с головой уходит в научную работу. Ему не терпится пристальнее рассмотреть различные органы и ткани. В исследованиях ученого отныне постоянно присутствует хоть и слабенький (всего 180-кратный), но микроскоп, и Мальпиги надеется на свой острый глаз и развитые еще в детстве фантазию и логику. Однажды, рассматривая в микроскоп легкое препарированной лягушки, ученый замечает, что оно состоит из мелких пузырьков, покрытых пленкой, и в этой пленке проглядывается сеть мельчайших кровеносных сосудов, соединяющая мелкие артерии и вены. Разгадка вопроса, который так и не был разрешен Гарвеем, открывшим круги кровообращения, но не знавшим, где артериальная кровь становится венозной, обнаружилась по ту сторону микроскопа у Мальпиги. В 1661 году ученый публикует статью о своем открытии в престижном журнале Лондонского королевского общества и, как бы ни злобствовал его давний противник профессор Монтальбани, находит поддержку у большей части коллег и соратников, в том числе у своего любимого учителя профессора Мариани. К сожалению, времени разделить с наставником радость научной победы Мальпиги досталось слишком мало: в 1662 году Мариани скоропостижно умирает, и Марчелло, удрученный и опустошенный потерей, принимает предложение возглавить кафедру медицины в университете Мессины. Там он четыре года занимается изучением растений, их анатомией и физиологией, все более виртуозно применяя микроскоп.
В 1666 году ученый вновь возвращается на кафедру Болонского университета. Его имя к тому времени известно далеко за границами родины, и спустя год Мальпиги соглашается на предложение вести регулярную переписку с Лондонским королевским обществом, полноправным членом которого становится в 1669-м. Английские ученые дали высокую оценку подробной монографии об анатомии шелковичного червя, написанной по предложению Королевского общества, и торжественно разместили портрет Мальпиги на почетном месте в одном из залов в Лондоне.
В 1669 году