Первым миланским заказом, полученным да Винчи в 1483 г., была икона для алтаря капеллы непорочного Зачатия церкви Сан-Франческо Гранде «Мадонна в гроте». Очертания фигур на ней смягчены знаменитой леонардовской дымкой – сфумато (дословно: «погруженный в туман, затуманенный»), которая отныне становится характерной чертой произведений мастера. Все детали пейзажа правдивы настолько, как если бы их изобразил самый искусный в живописи геолог и ботаник. Недаром именно Леонардо утвердил ботанику как самостоятельную дисциплину, дав классические описания листорасположения, гелио– и геотропизма, корневого давления и движения сока. До него лишь алхимики и фармацевты занимались растениями, но только да Винчи начал делать их детальные зарисовки и описывать свои наблюдения. Ученый явился и одним из основоположников палеонтологии, считая, что окаменелости, находимые на вершинах гор, опровергают утверждения церкви о «всемирном потопе». Он был первым, кто предположил, что ранее здесь находилось море, и поэтому нет ничего сверхъестественного в присутствии на такой высоте окаменелостей рыб и животных.
В начале 1480-х гг. Моро задумал увековечить память своего отца Франческо Сфорца, установив в Милане его бронзовую конную статую. Леонардо решил создать «коня», равного которому еще не было. От изображения животного, поднявшегося на дыбы, он отказался не столько по техническим, сколько по этическим соображениям: такое положение коня наверняка затмило бы героического всадника. Леонардо досконально изучил анатомию лошади, сделал множество подготовительных рисунков, уделяя особое внимание проблеме равновесия, и в конце концов изготовил полномасштабную модель из глины (1493 г.), которая принесла своему создателю известность. Дальнейшая судьба «коня» печальна: так и не дождавшись отливки в бронзе, статуя была разрушена в 1499 г., когда город захватили французские войска.
Созданная по заказу Лодовико Моро для трапезной доминиканского монастыря Санта-Мария делле Грацие стенная роспись «Тайная вечеря» (1495–1497 гг.) ныне принадлежит к самым известным произведениям мировой живописи. Мастер долго вынашивал композиционную идею, провел ряд расчетов и измерений, выстраивая перспективу, мучительно искал натурщиков, решился на смелый эксперимент с красками. Желая добиться наибольшей цветовой выразительности, он применил для фрески масло в смеси с темперой, предварительно загрунтовав стену составом из смолы и мастики собственного изобретения. Увы, этим он положил начало одной из величайших трагедий в истории искусства. Еще при жизни Леонардо краски начали отслаиваться и осыпаться, а проступавшая из стены влага покрыла поверхность картины уродливыми белесыми пятнами.