Сразу же после слов диакона «И во веки веков» хор поет «Аминь» и начинает пение Трисвятого: «Святый Боже, Святый Крепкий, Святый Безсмертный, помилуй нас». Эта песнь на иерейской Литургии поется трижды, затем хор поет «Слава, и ныне», «Святый Безсмертный, помилуй нас», и еще раз Трисвятое полностью единожды. Итого Трисвятое пропевается четыре с половиной раза.
Трисвятая песнь представляет собой еще одну молитву, которая напоминает о присутствии за богослужением ангелов. Происхождение этого гимна предание связывает с землетрясением, имевшим место в Константинополе в середине V века. Об этом говорит преподобный Иоанн Дамаскин в «Точном изложении православной веры»:
Составители церковной истории повествуют,[28] что, в то время как народ константинопольский совершал молебствие по случаю некоего ниспосланного Богом бедствия, совершившегося при архиепископе Прокле, случилось, что некий отрок был восхищен из народа и в таком состоянии некоторым ангельским научением был наставлен Трисвятой песни: «Святый Боже, Святый Крепкий, Святый Безсмертный, помилуй нас!» И как только отрок был возвращен и возвестил то, чему он был научен, то весь народ воспел гимн, и таким образом прекратилось угрожавшее бедствие.[29]
Существуют и другие мнения относительно происхождения Трисвятой песни. Некоторые Литургисты считают, что гимн «Святый Боже» был составлен святителем Василием Великим во время борьбы с арианами.[30] Как бы там ни было, первые документальные источники, упоминающие Трисвятое, относятся к середине V века. В частности, Трисвятое было торжественно пропето Отцами IV Вселенского собора (451) после низвержения Диоскора.[31]
В дни, посвященные Кресту Христову (Воздвижение, Присхождение древ, Неделя крестопоклонная), Трисвятое заменяется на слова «Кресту Твоему покланяемся, Владыко, и святое воскресение Твое славим». В праздники Рождества Христова и Богоявления, в Лазареву и Великую субботы, на Пасху и на Пятидесятницу вместо Трисвятого на Литургии поются слова апостола Павла «Елицы во Христа крестистеся во Христа облекостеся» (Гал. 3:27). Пение этого стиха на Литургии сохранилось с тех пор, когда великие праздники, такие как