Анализ полученного списка из 1659 работоспособных последовательностей показал сильнейшее взаимное влияние четырех аминокислотных позиций, то есть очень сильный эпистаз. Это второй главный результат исследования. В наличии эпистаза можно убедиться разными способами. Например, можно сравнить друг с другом последовательности, отличающиеся от AVST одной, двумя, тремя и четырьмя аминокислотами. Исследователи обнаружили среди функциональных (“разрешенных”) последовательностей 16 одиночных мутантов, 100 двойных, 544 тройных и 998 четверных, то есть таких, в которых все четыре аминокислоты отличаются от исходных A, V, S и T. Если бы эпистаза не было, то разрешенные множественные мутации представляли бы собой просто-напросто произвольные комбинации одиночных. Однако ничего подобного не наблюдается. Каждая отдельная аминокислотная замена оказывается разрешенной в одних сочетаниях и запрещенной в других. Из-за этого кратчайший разрешенный эволюционный путь от одной последовательности к другой в большинстве случаев оказывается длиннее, чем кратчайший из потенциально возможных (рис. 2.1).
Рассмотрим, например, переход от AVST к разрешенной последовательности MLAI (рис. 2.1, вверху слева). Чтобы превратить AVST в MLAI, нужно заменить четыре аминокислоты. Соответственно, если считать аминокислотную замену единичным эволюционным событием, то кратчайший путь от AVST к MLAI будет состоять из четырех шагов. Разных путей такой длины потенциально существует 24, поскольку аминокислоты можно заменять в разном порядке. Однако из этих 24 кратчайших путей разрешенными оказались только два. Все остальные пути требуют пересечения “пропасти” на ландшафте приспособленности, то есть прохождения через нефункциональный промежуточный этап.
рис. 2.1. Кратчайшие разрешенные эволюционные пути от AVST к последовательностям MLAI и SIQC. Функциональные (разрешенные) последовательности обведены рамками.