Схимонах старец Досифей, которого посетил Прохор, благословил его идти в Саровскую пустынь и спасаться там. Вернувшись ненадолго в родительский дом, Прохор навсегда простился с матерью и родными. 20 ноября 1778 года он пришел в Саров, где настоятелем тогда был мудрый старец, отец Пахомий. Он ласково принял юношу и назначил ему в духовники старца Иосифа. Под его руководством Прохор проходил многие послушания. Горя духом, он ежедневно служил в храме, непрестанно совершая молитвы и после службы. Господь сподобил преподобного благодатных видений во время церковных служб: неоднократно он видел святых ангелов, сослужащих братии. Особенно благодатного видения преподобный сподобился во время Божественной литургии в Великий Четверг, которую совершали настоятель отец Пахомий и старец Иосиф. Когда после тропарей преподобный произнес «Господи, спаси благочестивый» и, стоя в Царских вратах, навел орарь на молящихся с возгласом «и во веки веков», внезапно его осенил светлый луч. Подняв глаза, преподобный Серафим увидел Господа Иисуса Христа, идущего по воздуху от западных дверей храма, в окружении Небесных Безплотных Сил. Дойдя до амвона, Господь благословил всех молящихся и вступил в местный образ справа от Царских врат. Преподобный Серафим, в духовном восторге взирая на дивное явление, не мог ни слова проговорить, ни сойти с места. Его увели под руки в алтарь, где он простоял еще три часа, меняясь в лице от озарившей его великой благодати.
После видения преподобный усилил подвиги: днем он трудился в обители, а ночи проводил в молитве в лесной пустынной келье. В 1793 году, в возрасте тридцати девяти лет, преподобный Серафим был рукоположен в сан иеромонаха и продолжал служение в храме. После смерти настоятеля, отца Пахомия, преподобный Серафим, имея его предсмертное благословение на новый подвиг – пустынножительство, взял также благословение у нового настоятеля, отца Исайи, и ушел в пустынную келью в нескольких километрах от монастыря, в глухом лесу. Здесь стал он предаваться уединенным молитвам, приходя в обитель лишь в субботу, перед Всенощной, и возвращаясь к себе в келью после Литургии, за которой причащался Святых Тайн.
Преподобный проводил жизнь в суровых подвигах. Свое келейное молитвенное правило он совершал по уставу древних пустынных обителей; со Святым Евангелием никогда не расставался, прочитывая в течение недели весь Новый Завет, читал также святоотеческие и богослужебные книги. Преподобный выучил наизусть много церковных песнопений и воспевал их в часы работы в лесу. Около кельи он развел огород и устроил пчельник. Сам себе добывая пропитание, преподобный держал очень строгий пост, ел один раз в сутки, а в среду и пятницу совершенно воздерживался от пищи. Около трех лет преподобный питался только одной травой снытью, которая росла вокруг его кельи. К нему все чаще стали приходить, кроме братии, миряне – за советом и благословением.