Редактируя человечество: Революция CRISPR и новая эра изменения генома. Кевин Дейвис. Читать онлайн. Newlib. NEWLIB.NET

Автор: Кевин Дейвис
Издательство: Альпина Диджитал
Серия:
Жанр произведения:
Год издания: 2020
isbn: 9785002231942
Скачать книгу
Независимо от того, чей геном мы хотим отредактировать: хомяка или человека, комара или мыши, красной смородины или красного дерева, – процесс остается по сути одним и тем же. Это связано с тем, что все организмы в природе используют один и тот же универсальный код ДНК, состоящий из одного и того же четырехбуквенного алфавита.

      В своем естественном состоянии Cas9 не интересуется ДНК, в основном случайно сталкиваясь и отскакивая от нее. Но как только Cas9, имеющая форму ладони, захватывает направляющую РНК, точная реконфигурация структуры белка заставляет ее взаимодействовать с ДНК в поисках подходящей мишени. По словам Блейка Виденхефта, профессора Университета штата Монтана, белковые комплексы Cas «патрулируют все внутриклеточное пространство, находят чужеродную [вирусную] ДНК, связываются с ней и приговаривают ее к уничтожению в считаные минуты… это довольно впечатляющий процесс»[71].

      Поиск и связывание с целевой последовательностью происходят в два этапа. Прежде всего Cas9 ищет короткий мотив ДНК, называемый последовательностью PAM[72], – маяк, который дает ферменту сигнал для кратковременного связывания с ДНК, и взаимодействует с ним. «Это мимолетное взаимодействие приводит к искривлению ДНК», – объясняет Виденхефт. Изгибая ДНК, Cas9 расцепляет нити двойной спирали, чтобы направляющая РНК могла проскользнуть в образовавшуюся щель (создавая так называемую R-петлю)[73]. Направляющая РНК быстро сверяет последовательность с текстом целевой ДНК. Если будет найдено идеальное совпадение среди всех двадцати оснований (букв текста), то ДНК-последовательность будет уничтожена. Cas9 рассекает[74] обе нити ДНК так же ровно, как кухонный нож, создавая двухцепочечный разрыв (DSB, double-strand break) всего в нескольких основаниях от последовательности PAM[75].

      Этот удивительный процесс был потрясающе снят на видео исследователями Токийского университета Хироси Нисимасу и Осаму Нуреки в 2017 г. Используя метод, называемый высокоскоростной атомно-силовой микроскопией, они смогли увеличить изображение в тот самый момент, когда Cas9 захватывала молекулу ДНК. В фильме Cas9 выглядит как позолоченный камень, когда она останавливается на несколько секунд на нити ДНК, прежде чем разрубить ее пополам[76]. После того как Нисимасу выложил это видео в своем аккаунте Twitter, оно стало вирусным и было показано по японскому телевидению.

      Однако сориентировать Cas9, чтобы она искала конкретную уникальную последовательность в геноме человека, – это в миллионы раз сложнее, чем разрезать вирусную ДНК. Когда комплекс Cas9 входит в чужеродное пространство клеточного ядра, она сталкивается с лабиринтом ДНК – двадцатью тремя парами хромосом, шестью миллиардами букв ДНК (сравним со стандартным геномом фага, состоящим всего из нескольких тысяч оснований). Попадая в ядро, каждая молекула Cas9 обыскивает плотно упакованные спирали ДНК, чтобы найти последовательности PAM, которые встречаются в среднем один


<p>71</p>

CSHL Leading Strand, "CSHL Keynote, Dr Blake Wiedenheft, Montana State University," YouTube video, 21:21, last viewed June 26, 2020, https://www.youtube.com/watch?v=2x5VoReHV_4&t=.

<p>72</p>

Аббревиатура PAM расшифровывается как «мотив, смежный с протоспейсером» (от англ. Protospacer Adjacent Motif). Различные ферменты Cas распознают разные PAM, от трех до шести оснований. Наиболее часто используемая Cas9 из Streptococcus pyogenes распознает триплетную последовательность NGG, где N может быть любым из четырех оснований.

<p>73</p>

F. Jiang and J. A. Doudna, "CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms," Annual Review of Biophysics 46, (2017): 505–529, https://www.annualreviews.org/doi/full/10.1146/annurev-biophys-062215–010822.

<p>74</p>

Cas9 фактически имеет два активных сайта, обеспечивающих два отдельных процесса расщепления – по одному для каждой цепи двойной спирали.

<p>75</p>

HHMI BioInteractive, "CRISPR-Cas9 Mechanism & Applications," https://www.biointeractive.org/classroom-resources/crispr-cas-9-mechanism-applications.

<p>76</p>

M. Shibata et al., "Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by highspeed atomic force microscopy," Nature Communications 8, (2017): 1430, https://www.nature.com/articles/s41467–017–01466–8.