Однако Брестская уния наткнулась на горячий и решительный отпор со стороны широких народных масс. Уклонялись от перехода в униатство и часть православной шляхты и даже несколько крупных магнатов (князья Острожский, Корецкий, Четвертинский и другие). В результате вместо безболезненного захвата католичеством Украины, на что рассчитывали инициаторы унии, на ее землях началась ожесточенная религиозная борьба.
Униатские епископы, при поддержке польского правительства, захватывали православные церкви и монастыри и препятствовали православным богослужениям и совершению обрядов. На православных мирян производилось всяческое давление, до применения физического воздействия включительно, чтобы заставить их перейти в унию. В селах православные церкви, стоявшие на землях шляхты (а владеть землей могла только шляхта), сдавались в аренду евреям, которые каждый раз за открытие церкви для совершения богослужений и треб взымали особую плату. Православных монахов ловили, заковывали в кандалы и сажали в тюрьму.
Жаловаться было некому. Правительство Речи Посполитой не только оставалось глухим ко всем жалобам своих православных граждан на бесчинства униатов, но и всемерно эти бесчинства и беззакония поддерживали и в них участвовали. Митрополит Рогоза, возглавлявший православную церковь на Украине, сам перешел в унию, как и значительная часть епископов. Только епископ Львовский – Балабан, и епископ Перемышльский – Капустинский остались верны православию и мужественно за него боролись.
Сохранилось много исторических документов и свидетельских показаний того времени, являющихся страшными обвинительными актами против польско-католической агрессии при попытке насаждении унии на Украине. Например, на польском сейме в присутствии короля депутат от Волыни православный шляхтич Древницкий говорил: «В Могилеве, в Орше и Пинске церкви позапечатаны, священники разогнаны, Лещинский монастырь превращен в кабак; дети умирают без крещения; тела умерших вывозятся как падаль, без церковного благословения; народ живет в распутстве, не венчанный… А что делается во Львове? Кто не принимает унии, тот не может жить в городе, заниматься торговлею, быть принятым в ремесленные цехи. А в Вильно? – Монахов, непреклонных унии, ловят, бьют и в кандалы заковывают. Тела умерших православных заставляют вывозить только через те ворота, через которые вывозят только нечистоты…»
К концу XVI века вся территория, заселенная украинцами, очутилась под властью феодалов польской культуры и католического вероисповедания. О размерах их владений можно судить по сохранившимся данным. Так, Конецпольскому только на Брацлавщине (район южного Буга) принадлежало 740 сел и 180 городов и местечек. Потоцкому принадлежало все Нежинское староство (область) и Кременчуг с окрестностями. Князю Иеремии Вишневецкому – почти вся Полтавщина с 10 тысячами крестьянских и мещанских дворов-хозяйств. Немалые владения имели католические