Następnie przyszedł czas na genialny drugi etap eksperymentu. Na kolejne 24 godziny de Mairan umieścił roślinę w szczelnie zamkniętym pojemniku, pogrążając ją w całkowitych ciemnościach nie tylko w nocy, ale również za dnia. W tym czasie zaglądał do środka w warunkach kontrolowanej ciemności, aby zaobserwować stan liści. Mimo odcięcia od światła roślina zachowywała się tak, jakby oblało ją światło słoneczne: rozłożyła dumnie liście. Potem schowała je na całą noc, jakby na sygnał, pod koniec dnia, choć nie miała dostępu do zachodzącego słońca.
Było to rewolucyjne odkrycie: de Mairan wykazał, że żywy organizm dysponuje własnym zegarem, a nie jest niewolnikiem rozkazów wydawanych rytmicznie przez słońce. Gdzieś we wnętrzu rośliny funkcjonował generator rytmu dobowego, który potrafił odmierzać czas bez żadnych wskazówek ze świata zewnętrznego. Roślina nie tylko dysponowała rytmem dobowym, ale także rytmem „endogennym”, wytwarzanym przez nią samą. Podobnie zachowuje się serce, które bije w wytwarzanym przez siebie rytmie. Różnica polega tylko na tym, że serce bije szybciej, zwykle co najmniej raz na sekundę, a nie raz na 24 godziny.
Co zaskakujące, dopiero dwieście lat później dowiedziono, że ludzie dysponują podobnym, generowanym wewnętrznie cyklem dobowym. Tak się złożyło, że eksperyment ten przyniósł dość zaskakujące odkrycie związane z naszym rozumieniem zegara biologicznego. Był rok 1938 i profesor Nathaniel Kleitman z Uniwersytetu Chicagowskiego, w towarzystwie asystenta Bruce’a Richardsona, postanowił przeprowadzić jeszcze bardziej radykalne badanie naukowe. Wymagało od nich poświęcenia, na które dziś pewnie mało kto by się zdobył.
Kleitman i Richardson uczynili królikami doświadczalnymi samych siebie. Obładowani jedzeniem i piciem na sześć tygodni oraz parą wycofanych z użytku szpitalnych łóżek na wysokich nogach udali się do Jaskini Mamuciej w Kentucky, jednej z najgłębszych jaskiń na Ziemi – tak głębokiej, że do jej najdalszych zakamarków nie dociera nawet najmniejsza ilość światła słonecznego. Właśnie z tych ciemności Kleitman i Richardson rzucili światło na niezwykły fakt, że rytm odmierzany przez nasz wewnętrzny zegar wynosi około jednego dnia, a nie dokładnie jeden dzień.
Poza jedzeniem i piciem mężczyźni zabrali ze sobą szereg urządzeń, którymi mierzyli temperaturę ciała, a także rytm snu i czuwania. Centrum pomiarowe leżało na środku zamieszkiwanej przez nich przestrzeni, z obu stron otaczały je łóżka. Każda z ich wysokich nóg stała zanurzona w wiadrze wody, swoistej fosie, która miała chronić badaczy przed wizytami niezliczonych małych (i wcale nie tak małych) stworzonek żyjących w głębi jaskini.
Kleitman i Richardson postawili sobie proste pytanie: czy po odgrodzeniu się od naturalnego dobowego cyklu światła i ciemności ich biologiczny rytm snu i czuwania, wraz z temperaturą ciała, zupełnie się rozreguluje czy też zachowa taką samą postać jak u ludzi przebywających w świecie zewnętrznym, poddanych wpływowi rytmicznej naprzemienności dnia i nocy? W jaskini wytrwali w sumie 32 dni. Przez ten czas nie tylko wyhodowali sobie imponujący zarost, ale dokonali dwóch przełomowych odkryć. Po pierwsze, okazało się, że w sytuacji braku dostępu do światła słonecznego ludzie, podobnie jak heliotropowe rośliny de Mairana, wytwarzają własny, endogenny rytm dobowy. W praktyce oznaczało to, że ani Kleitman, ani Richardson nie zaczęli funkcjonować w chaotycznych odcinkach snu i jawy, ale pojawił się u nich przewidywalny i powtarzający się cykl wydłużonych okresów czuwania (około piętnastogodzinnych) przedzielonych okresami nieprzerwanego, około dziewięciogodzinnego snu.
Drugie, nieoczekiwane – i donioślejsze – odkrycie dotyczyło tego, że ich powtarzające się regularnie cykle snu i jawy nie trwały dokładnie 24 godziny, ale regularnie dłużej. U dwudziestokilkuletniego Richardsona wytworzył się cykl snu i jawy o długości od 26 do 28 godzin. Cykl czterdziestokilkuletniego Kleitmana był nieco bardziej zbliżony do 24 godzin, ale jednak od nich dłuższy. Okazało się zatem, że po odcięciu od wpływu światła dziennego wewnętrznie generowana „doba” wynosiła u każdego z nich nie dokładnie 24 godziny, ale nieco więcej. Niczym zepsute zegarki, które trochę się spóźniają, z każdym upływającym (prawdziwym) dniem w świecie zewnętrznym organizmy Kleitmana i Richardsona zaczęły opóźniać nadejście kolejnego dnia zgodnie z własnym, powolniejszym, generowanym wewnętrznie zegarem.
Ponieważ nasz naturalny rytm biologiczny nie wynosi dokładnie 24 godziny, ale z grubsza tyle, konieczne było stworzenie nowego nazewnictwa. W ten sposób powstał angielski termin circadian rhythm – oznaczający rytm wynoszący około jednego dnia, a nie dokładnie jeden dzień8. W czasie siedemdziesięciu kilku lat, które upłynęły od przełomowego eksperymentu Kleitmana i Richardsona, zdołaliśmy ustalić, że przeciętna długość endogennego rytmu dobowego u ludzi wynosi około 24 godzin i 15 minut. Różnica wynosi zatem niewiele w porównaniu z 24 godzinami, jakie zajmuje Ziemi obrót wokół własnej osi, ale więcej, niż byłby gotów zaakceptować jakikolwiek szanujący się szwajcarski wytwórca zegarków.
Na szczęście większość z nas nie żyje w Jaskini Mamuciej ani w nieustannych ciemnościach. Regularnie podlegamy wpływowi światła słonecznego, które koryguje wskazania nieprecyzyjnego, spóźniającego się wewnętrznego zegara biologicznego. Promienie słoneczne pełnią funkcję palca, który dzień w dzień metodycznie reguluje pokrętłem wskazania naszego rozregulowanego wewnętrznego czasomierza, „nastawiając” nas z powrotem na dobę o długości dokładnie – a nie około – 24 godzin9.
Nasz mózg nieprzypadkowo posługuje się światłem słonecznym do regulacji zegara biologicznego. Jest ono najbardziej niezawodnym, powtarzalnym sygnałem występującym w naszym środowisku. Każdego dnia od narodzin naszej planety słońce niezawodnie wstawało rano i zachodziło wieczorem. Większość istot żywych dostosowała się do rytmu dobowego prawdopodobnie po to, aby zsynchronizować swoje funkcjonowanie i aktywność, zarówno wewnętrzną (na przykład temperaturę), jak i zewnętrzną (na przykład odżywianie) z obrotem Ziemi wokół własnej osi, który skutkuje regularnymi okresami jasności (kiedy słońce wschodzi) i ciemności (kiedy słońce chowa się za horyzontem).
Ale światło słoneczne nie jest jedynym sygnałem, który nasz mózg może wykorzystać do regulacji zegara biologicznego, mimo że w normalnych warunkach jest sygnałem podstawowym i uprzywilejowanym. Mózg może również czerpać z innych wskazówek, jeśli tylko powtarzają się w stałych odstępach czasu, na przykład pór posiłków, zmian temperatury, a nawet odbywających się o stałej godzinie interakcji społecznych. Wszystkie one mogą przestawiać zegar biologiczny, dostrajając go do precyzyjnego 24-godzinnego rytmu. Właśnie z tego powodu osoby z niektórymi formami ślepoty nie tracą całkowicie rytmu dobowego. W sytuacji braku sygnałów świetlnych funkcję regulatorów rytmu dobowego przejmują inne czynniki. Sygnał wykorzystywany przez mózg w celu dostrajania zegara biologicznego to tak zwany Zeitgeber, co po niemiecku znaczy „dawca czasu” albo „synchronizator”. Tak więc choć światło dzienne jest najbardziej niezawodnym, a przez to głównym, Zeitgeberem, istnieje wiele czynników, które mogą być wykorzystywane jako jego uzupełnienie albo pod jego nieobecność.
24-godzinny zegar biologiczny umiejscowiony w środku naszego mózgu