Приход к власти нового польского короля Сигизмунда III резко изменил ситуацию. Он был ярым католиком, его духовником был известный богослов иезуит Петр Скарга, который оказывал на короля сильное влияние. Политика Сигизмунда, направленная на открытое вмешательство в дела Московского государства (эпоха русской Смуты), еще больше способствовала поддержке идеи оторвать украинские земли от православия и таким образом лишить ее духовного единства с Москвой.
Скарга издал ряд богословских трактатов, в которых высмеивал религию, базирующуюся на церковнославянском языке. Он писал (и не без оснований), что к тому времени не существовало ни одной академии, в которой бы науки преподавались на старославянском языке, его никто не понимал и не мог на нем читать. Сами священники, писал Скарга, отправляющие богослужение, не могут объяснить того, что они читают в церкви. Доказывая невежество и несостоятельность церкви, основанной на церковнославянском языке, Скарга сам того не желая, дал толчок к действию своим противниками.
Первым православным литературно-просветительским центром в Великом княжестве Литовском стал кружок русского политического эмигранта Андрея Курбского, созданный им в Миляновичах на Волыни. Курбский учился литературе у Максима Грека и старца Артемия. На Волыни он изучил латынь, диалектику и «внешние науки» у Амброжия Брежевского. Курбскому удалось привлечь целый ряд образованных людей – двоюродного брата князя Михайло Оболенского (после пятилетнего обучения в Кракове и Италии), Марка Саригозина (ученика Максима Грека), Станислава Олишевского, Брума, Бартоломея и др. Главной целью Курбский ставил создание научных переводов. Он утверждал, что католики приватизировали византийскую литературу, которую необходимо вернуть православным, делая переводы на церковнославянский язык. Он финансировал приобретение книг, бумаг, а также поездки в другие культурные центры. Миляновицкие переводы были популярны и в различных списках распространялись по Украине, Белоруссии и России на протяжении XVI–XVII вв.
Огромную роль в деле начала духовного возрождения Украины и создания системы православного образования, сыграл представитель древнего княжеского рода Константин Острожский. Магнат, обладавший огромными имениями на Волыни, в 1574 г. он перенес столицу своих владений в город Острог, где начал создавать центр ученого православия.
Своей главной целью создававшийся Острожский кружок поставил полное издание Библии на церковнославянском языке, которого до того момента не имелось. Православные богословы вынуждены были в своей полемике использовать рукописные отрывки отдельных частей Библии, в которых было немало ошибок.
Острожский выписал несколько библейских книг от патриарха Иеремии, с острова Кандии, из греческих, сербских и болгарских монастырей.