Первым полком, освоившим самолет в 1949 г., стал 203-й гв. тбап 45-й тбад (Барановичи). Командир полка гв. п/п-к Пономаренко В.В. первым освоил самолет Ту-4. Вторым – флагманский экипаж ДА п/п-ка Вагапова И.Ш. Освоение Ту-4 вслед за полками 45-й дивизии 50-й ВА начали в 13-й гв. тбад (командир п-к Сажин Н.И.) 43-й ВА. В 13-ю дивизию входили 185, 202 и 226-й гв. полки. Первым переучивание начал 185-й тбап, а с апреля 1949 г. – 202-й и 226-й полки. Первые 6 Ту-4 приземлились в Полтаве в июле 1949 г., и в том же месяце уже начались полеты в составе штатных экипажей. В начале сентября в полку началось освоение маршрутных полетов с бомбометанием днем с последующим переходом к полетам ночью. Всего было переучено 72 командира корабля и 67 экипажей. Средний налет при переучивании составлял 14 часов. В процессе освоения самолета налет составлял 80—120 час.
Заводы ежедневно выкатывали на приемную стоянку самолеты. Для ускорения их перегонки в части от 185-го гв. тбап была выделена группа экипажей. Для ускорения подготовки экипажей на Ту-4 была привлечена Высшая офицерская школа экипажей Дальней авиации в Рязани.
Часть самолетов Ту-4 были модернизированы в вариант разведчика. В Ту-4 Р в бомбоотсеках устанавливали фотоаппараты АФА-33 или – ЗЗМ с 1000-мм объективами, позже стали применять и другую технику, например, ночной НАФА-5 с/100. Объем бомбоотсека позволил установить самые большие кассеты, вмещавшие 190–195 кадров фотопленки размером 300×300 мм.
В начале 50-х годов в набор оборудования Ту-4 Р была включена станция радиоразведки ПР-1, способная засекать локаторы, работающие в диапазонах от «А» до «Д» (от 150 до 3100 МГц). Кроме того, она могла определить направление на них и «глушить» РЛС противника «шумовыми» помехами в диапазоне «Д» – от 2600 до 3100 МГц (из-за этого ее иногда называли ПР-Д). С 1954 г. Ту-4 Р начали комплектоваться широкополосными помеховыми станциями СПС-1. Кроме того, в бомбоотсеке можно было разместить устройство для постановки пассивных помех ДОС, обеспечивавшее выброс дипольных отражателей в виде станиолевых лент или коротких стеклянных иголок с металлическим покрытием. Обслуживали станции ПР-1, СПС и установку ДОС офицер по радиопротиводействию и борттехник службы помех. Станция ПР-1 ставилась вместо коек для отдыха.
В каждой воздушной армии был сформирован дальний разведывательный полк на Ту-4, некоторые бомбардировочные полки переоснастили разведчиками и полностью переключили на выполнение задач радиопротиводействия. Одним из них был 202-й тбап в Миргороде.
Самолет Ту-4 в период 1949–1958 гг. был на вооружении 24 полков ДА: 18, 52, 121, 132, 175, 183, 184, 185, 199, 200, 202, 203, 219, 226, 251, 260, 303, 341, 402, 444, 454, 840, 1225, 1229-го.
Самолет был очень надежным, за время его эксплуатации в ДА произошло всего пять катастроф: в 203, 184, 199, 454 и 251-м тбап.
Выпущенный в марте 1952 г. последний Ту-4 в октябре 1958 г. был посажен на аэродроме Монино летчиком Алтуховым и передан в музей ВВС. Этим полетом была поставлена точка в истории первого стратегического самолета-носителя СССР. На смену ему шел реактивный Ту-16.