Его историческое завещание, состоящее всего из 300 слов, написанное в Париже за год до кончины – 27 ноября 1895 года, стало достоянием общественности через месяц после его смерти. В завещании Альфред Нобель предусмотрел разделение призового фонда на пять равных частей, присуждаемых следующим образом:
одна часть – лицу, которое совершит наиболее важное открытие или изобретение в области физики;
вторая часть – лицу, которое добьется наиболее важного усовершенствования или совершит открытие в области химии;
третья часть – лицу, которое совершит важное открытие в области физиологии или медицины;
четвертая часть – лицу, которое в области литературы создаст выдающееся произведение идеалистической направленности;
пятая часть – лицу, которое внесет наибольший вклад в дело укрепления содружества наций, в ликвидацию или снижение напряженности противостояния вооруженных сил, а также в организацию или содействие проведению конгрессов миролюбивых сил.
В 1968 году Шведский банк в связи со своим 300-летием дополнительно к нобелевскому перечню учредил премию по экономическим наукам памяти Альфреда Нобеля.
Согласно завещанию награды по физике и химии присуждаются Королевской шведской академией наук, в области физиологии или медицины – Каролинским институтом в Стокгольме, премии по литературе – Шведской академией; премия мира – специальным комитетом из пяти выбираемых норвежским парламентом (стортингом) членов; наконец позже, присуждение премий в области экономики взяла на себя Королевская шведская академия наук.
В связи с важностью завещания шведское правительство, распорядившись имуществом Нобеля и учредив премию его имени, создало устав